DNA'ya harf harf yazan daktilo, bir fare embriyosunun soy ağacını çıkardı

Bu rakamın ağırlığını anlamak için şunu bilmek gerekiyor: bugüne kadar hücre soy ağacı eksiksiz çizilebilmiş tek hayvan, bir milimetre boyundaki bir solucandı.

Kırk yıl boyunca yalnızca bir solucan

Hücre soy ağacı — İngilizcedeki adıyla lineage tracing — bir organizmadaki her hücrenin hangi bölünme zincirinden geçerek o hâle geldiğini gösteren şema. Mantığı aile şeceresine benziyor: tepede döllenmiş yumurta var, her dal bir bölünme, en uçtaki yapraklar da bugünkü hücreler.

Bu şema şimdiye kadar yalnızca Caenorhabditis elegans için eksiksiz çizilebildi. 1980'lerin başında John Sulston ve arkadaşları bu toprak nematodunu mikroskop altında saatlerce izleyip her bölünmeyi elle not etti. İş mümkündü, çünkü solucan küçük, şeffaf ve neredeyse değişmez: yetişkin hermafroditte her zaman 959 vücut hücresi bulunuyor ve her biri aynı yolu izleyerek oluşuyor. Sulston, Sydney Brenner ve H. Robert Horvitz, organ gelişiminin genetiği ve programlı hücre ölümü üzerine çalışmalarıyla 2002 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'nü aldı.

Memelilerde bu üç kolaylığın hiçbiri yok. Hücre sayısı milyonlarca kat fazla, embriyo opak, gelişim de rastlantı payı taşıyor: aynı türün iki embriyosunda bölünme sırası birebir aynı olmuyor. Yani mikroskopla oturup izlemek seçenek değil.

Araştırmacılar bu yüzden dolaylı yollara başvurdu. Bir yöntem, hücrelere floresan boya ya da ışıyan protein geni verip soyunu renkten takip etmekti; ama renk hücre bölündükçe seyreliyor ve yalnızca birkaç kabaca ayrılmış gruba yetiyordu. Tek hücre dizilemenin yaygınlaşması, bir embriyodaki yüz binlerce hücrenin hangi tipte olduğunu söylemeyi mümkün kıldı — fakat fotoğraf karesi veriyordu, akrabalık değil. 2016'dan sonra devreye genom düzenlemeye dayalı fikir girdi: hücrelerin DNA'sında rastgele kesikler açıp bıraktıkları izleri birer rozet gibi kullanmak. Aynı rozeti taşıyan hücreler akraba demekti.

Rozet var, sıra yok

Bu yaklaşımın iki aksaklığı vardı. Birincisi, iki kesik aynı bölgeye denk gelince ikincisi birincisinin izini silebiliyor, arada kalan parça büsbütün kaybolabiliyordu. İkincisi ve daha can sıkıcı olanı: elinizde bir hücrenin taşıdığı izler topluluğu oluyor ama hangisinin daha önce oluştuğunu söyleyemiyordunuz. Sırasını bilmediğiniz notlardan zaman çizelgesi çıkarmaya benziyor.

DNA daktilosunun çözdüğü sorun tam olarak bu. Yöntemi 2022'de Nature'da tanıtan Junhong Choi ve Jay Shendure, genoma TAPE adını verdikleri yapay bir bant yerleştirdi. Bant, arka arkaya dizilmiş boş birimlerden oluşuyor. Yazma işini yapan araç ise prime editing: kesip atmak yerine, etkinliği kısıtlanmış bir Cas9 enzimiyle ters transkriptazın birleştirildiği bir füzyon protein, rehber RNA'nın üzerinde taşıdığı şablonu hedefe doğrudan kopyalıyor. Böylece DNA'ya çift zincirli kırık açmadan, istenen kısa dizi yazılabiliyor.

İşin bütün hünerine kaynaklık eden ayrıntı şu: banda yeni bir harf yalnızca bir önceki harfin bıraktığı ek yerine yazılabiliyor. Yani ikinci birim, ancak birinci birim dolduktan sonra yazılabilir hâle geliyor. Bant kesin olarak soldan sağa doluyor ve bir harfin banttaki konumu, o harfin ne zaman yazıldığını söylüyor.

Benzetmesi şöyle: otel defterine imza attığınızı düşünün, kural da yalnızca ilk boş satıra imza atabilmeniz olsun. Kimsenin saatini yazmasına gerek kalmaz; defterdeki sıra zaten kim önce geldiğini anlatır. Ya da ağaç gövdesindeki yıl halkaları gibi — halkanın kendisi bir tarih taşımıyor, ama dizilişi taşıyor.

Haedong Kim, UW Medicine bülteninde yöntemi şöyle anlatıyor: "Bunu gerçek bir daktilo gibi düşünün; yalnızca kâğıda değil, hücrenin kendi DNA'sına yazıyor. Hücre her bölündüğünde bir sonraki boş satıra yeni bir karakter vuruyor." Yazılan karakterler rastgele seçildiği için, bir hücrede ortaya çıkan harf dizisi neredeyse tekilleşiyor; iki hücrenin bandında aynı harfler aynı sırayla duruyorsa bu, o harflerin yazıldığı ana kadar ortak bir atadan geldiklerinin işareti oluyor.

Yüz zigottan bir soy ağacı

Ekip, prime editing düzeneğini, rehber RNA'ları ve halka hâline getirilmiş bant RNA'sını doğrudan döllenmiş fare yumurtalarının çekirdeğine enjekte etti. Sonra embriyoların normal gelişmesine izin verdi ve 13,5. günde — fare gebeliğinin yaklaşık üçte ikisi, organların şekillendiği dönem — hücreleri tek tek çekirdek düzeyinde diziledi. Her hücrenin hem hangi tipte olduğu hem de bandına ne yazıldığı aynı anda okundu; akrabalık ağacı bu iki bilgi birleştirilerek kuruldu.

Aşağıdaki sayılar Science makalesinin ön baskısından, UW Medicine bülteninden ve ekibin yayımladığı NextCell tarayıcısından derlendi.

İlk bölünme asimetrik çıktı, ama tarafsız

Ağacın en tepesindeki soru en basiti: döllenmiş yumurta ikiye bölündüğünde oluşan iki hücreden hangisi neye dönüşüyor? Kayıt, bu ilk bölünmeyi hiç tartışmaya yer bırakmadan işaretliyordu. İki hücrenin embriyoya katkısı eşit değildi — biri belirgin biçimde daha fazla torun bıraktı. Buna karşın ikisi de hücre tipi çeşitliliği bakımından ayrım göstermedi; yani "şu hücre ileride kas, bu hücre ileride sinir olacak" diye bir ön yazgı yoktu. Bu da araştırmacıların eline beklenmedik bir kolaylık verdi: aynı embriyonun iki yarısı, birbirinin iç kontrolü gibi kullanıldı ve bulguların hepsi iki yarıda ayrı ayrı doğrulandı.

Ağaç biraz daha aşağı inildiğinde tablo değişiyor. Gastrulasyon öncesinde ortaya çıkan az sayıda "kurucu" hücre, embriyonun büyük bölümünü doğuruyor; aralarındaki eşitsizlik, kurucuların belirlenmesinden bir-iki bölünme sonrasında şansın öngördüğü düzeyi aşıyor. Ne var ki bu kurucular hâlâ geniş biçimde çok yönlü, yani tek bir dokuya kilitlenmiş değil. Organ oluşumu sırasında bazı hatlarda ikinci bir baskınlık dalgası beliriyor.

En çarpıcı sonuç kaderin ne zaman belirlendiğine dair. Hücre tipleri hep birlikte, tek bir anda kesinleşmiyor. Kan hücreleri ve retina göreli olarak erken yolunu seçiyor; derinin dış katmanı ise belirgin biçimde daha geç kesinleşiyor. Her hücre tipinin kendi takvimi var. Shendure bültende ekibin amacını şöyle özetliyor: "Bir embriyodaki hücrelerin erken atalarının, sonraki kaderlerini nasıl etkilediğini izlemekle ilgileniyoruz."

Ağacın en ince ucunda da bir düzen çıktı: kardeş hücreler aynı hücre tipinde olmayı rastlantıdan 9 kat fazla paylaşıyor. Mekânsal olarak kısıtlı kurucu havuzlarından doğan hücre tiplerinde bu oran 68 ile 107 kat arasına çıkıyor. Yalnızca hangi hücrelerin aynı dalda bir arada bulunduğuna bakılarak, embriyonun üç temel tabaka düzeni ve hücre tipleri arasındaki akrabalık hiyerarşisi yeniden elde edilebildi; bu hiyerarşideki ayrılma noktaları 8,5. günden itibaren tarihlendirilebiliyor. Yani ağaç, bilinen gelişim biyolojisini sıfırdan yeniden üretiyor — bu da onun bilinmeyen kısımlar için de güvenilir olabileceğine işaret ediyor.

Bulgunun sınırı nerede

Çalışma kendi sınırlarını da gösteriyor ve bunlar küçük değil.

• Tek embriyo. Ayrıntılı ağaç bir tek embriyodan çıkarıldı. Diğer dokuz embriyo yöntemin işlediğini gösteriyor, ama "fare gelişimi genel olarak böyledir" demek için tek örnek yeterli değil; gelişimdeki rastlantı payı tam olarak bunu gerektiriyor.
• Örneklem embriyonun onda biri. NextCell'deki 1,28 milyon hücre, o aşamadaki embriyodaki hücrelerin yaklaşık yüzde 10'u. Ağacın dalları yoğun, ama eksiksiz değil.
• Bant bitiyor. Her biri 6 birimlik 11 bant kopyası, kayıt kapasitesine üst sınır koyuyor. Bu yüzden kayıt doğuma kadar değil, 13,5. güne kadar sürüyor. Doğum sonrası gelişimi, yaşlanmayı ya da bir dokunun yıllar içindeki yenilenmesini izlemek için daha uzun bant gerekiyor.
• Verim düşük. 100 döllenmiş yumurtadan 10 yaşayabilir embriyo elde edildi, ayrıntılı çözümleme bir tanesinde yapıldı. Yöntem henüz rutin bir laboratuvar işlemi değil.
• İnsana doğrudan uygulanamaz. Düzenek, döllenmiş yumurtanın çekirdeğine enjeksiyon gerektiriyor. İnsanda yapılacak bir işlem değil ve araştırmacılar da böyle bir şey önermiyor. Değeri, insan gelişimine model olan bir canlıda referans harita çıkarmakta.
• "Nasıl" değil, "kim". Soy ağacı bir hücrenin kimden geldiğini söylüyor; neden o yolu seçtiğini söylemiyor. Bunun için başka deney türleri gerekiyor.

Ayrıca bu bir doğrudan sağlık bulgusu değil. Doğumsal gelişim bozuklukları, sinir gelişimi ya da kanserin hücre kökeni gibi başlıklar araştırmacıların uzak hedefleri arasında anılıyor; bugün hastaya dönük bir karşılığı yok.

Sırada ne var

Ekip verinin tamamını ve NextCell tarayıcısını serbest erişime açtı — bir memeli embriyosunun soy ağacını açıp dolaşmak artık herkesin yapabileceği bir şey. Yöntemin kendisi ise açık bir mühendislik sorusuyla baş başa: bandı uzatıp yazma hızını daha iyi ayarlamak. Bugünkü hâliyle daktilo, embriyonun ilk üçte ikisini yazmaya yetiyor. Bütün bir fare ömrünü kaydedecek kadar uzun bir bant takılabilirse, merak edilen soru da değişiyor: bir dokunun yıllar içinde hangi hücrelerden yenilendiğini, ya da bir tümörün ilk hangi hücreden yola çıktığını, hücrelerin kendi tuttuğu kayıttan okumak mümkün olur mu?

Fotoğraf: Pazit Polak from Basel, Switzerland, CC BY 2.0, Wikimedia Commons